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      項目文章|赫捷院士課題組nature子刊揭示METTL3以m6A依賴的方式調控食管鱗癌
      日期:2021年08月25日    來源:
      本期分享云序客戶中國醫學科學院腫瘤醫院赫捷院士團隊2021年6月21日發表“METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding”的文章,作者發現食管鱗狀細胞癌組織中mettl3高度表達,運用m6A-MeRIP-seqRNA-seq的發現METTL3上調APC 的m6A修飾,從而招募YTHDF降解APC 。APC表達減少后增加了β-catenin和β-catenin介導的cyclin D1、c-Myc和PKM2的表達,從而促進小鼠有氧糖酵解、ESCC細胞增殖和腫瘤形成。此外,APC表達下調與人食管鱗癌標本中metll3表達上調及食管鱗癌患者預后不良相關。文章揭示了ESCC細胞通過METTL3/YTHDF偶聯下調APC從而使中Wnt/β-catenin通路更活躍,這一發現為腫瘤治療提供新的理論基礎。云序生物有幸參與了本次研究當中的m6A-MeRIP-seq和RNA-seq的測序服務以及生信分析。
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      發表期刊:Nature Communications
      發表日期:2021年6月21
      影響因子:14.919
      研究方法:m6A meRIP-seqRNA-seq
      文章鏈接:METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediatedby APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding

      研究內容:
      (1)METTL3上調與ESCC患者的低生存率相關
      為了探討METTL3在食管鱗癌中的表達情況,作者分析了TCGA數據發現與鄰近正常食管上皮組織相比,食管鱗癌標本中METTL3的表達明顯上調(Fig. 1a)。與此結果一致的是,對ESCC標本和鄰近正常食管上皮組織進行免疫組化(IHC)染色(Fig. 1b,c)顯示METTL3在ESCC組織中的表達水平顯著高于相鄰的正常組織。Kaplan-Meier分析顯示,METTL3高表達的患者總生存時間短于低表達的患者(Fig. 1d)。同時METTL3 基因和蛋白(Fig. 1e)在9種不同的食管鱗癌細胞系中表達水平均高于正常食管上皮細胞。這些結果表明,METTL3在食管鱗癌中表達上調,且與食管鱗癌患者生存時間呈負相關。
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      (2)METTL3促進小鼠ESCC細胞增殖和腫瘤生長
      為了確定METTL3在細胞增殖中的作用,作者對METTL3進行了敲降。結果表明,METTL3的敲降減少了細胞的增殖(Fig. 2a)和集落數量(Fig. 2b)。這些抑制作用通過在KYSE180中重組表達一個耐RNA干擾的Flag-tagged mettl3恢復(Fig. 2c,d)。然后用四環素誘導表達在KYSE450細胞中的METTL3。四環素處理增加METTL3的表達且呈劑量依賴性,相應增加了細胞增殖水平(Fig. 2e)和集落形成(Fig. 2f)。與野生型(WT)相比,在ESCC細胞中過表達METTL3不活躍的突變體不能顯著促進細胞的生長和增殖(Fig. 2g,h)。這些結果表明,METTL3促進腫瘤細胞增殖依賴于其表達水平和完整的活性。
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      為了確定METTL3在小鼠腫瘤生長中的作用,將KYSE180或KYSE450細胞皮下注射到無胸腺裸鼠中。發現敲除METTL3可以減少腫瘤的大小(Fig. 2i)、體積(Fig. 2j)和權重(Fig. 2k)。與METTL3不活躍的突變體相比,WT METTL3過表達極大地促進了腫瘤的生長(Fig. 2l,n)。這些結果表明,METTL3的表達有助于小鼠腫瘤的生長。
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      (3)METTL3介導APC mRNA m6A的上調
      為了確定METTL3促進腫瘤細胞增殖的機制,作者檢測了METTL3在ESCC細胞調控中的作用。METTL3 KO降低了KYSE180細胞中總m6A豐度(Fig. 3a)。m6A meRIP-seq和RNA-seq發現KYSE180中motif序列與m6A共識序列RRACH一致(Fig. 3b)。m6A信號在終止密碼子和3’UTR區富集(Fig. 3c)。METTL3 KO中1101個基因中1199 m6A峰發生差異變化,RNA-seq顯示有2973個基因發生了差異表達。在這些基因中,包括APC在內的93個基因存在重疊(Fig. 3d)。在METTL3 KO中m6A-MeRIP-seq中GO分析CC部分顯示,β-catenin敲除復合物的基因組中m6A水平顯著降低,包括APC。APC是Wnt負調控因子,促進β-連環蛋白降解。m6A峰位于APC終止密碼子區附近的最后一個外顯子,METTL3的耗盡降低了APC 的m6A水平(Fig. 3e)。miCLIP數據分析顯示,APC 上有三個腺苷堿基被甲基化,并且位于METTL3 KO 后APC m6A峰的降低范圍內(Fig. 3f)。這些結果表明,METTL3調控APC 的m6A水平。meRIP-qPCR檢測METTL3 KO后APC 中m6A水平明顯降低(Fig. 3g)。相反,METTL3過表達增加了APC中的m6A水平(Fig. 3h),這一現象受METTL14敲除恢復。此外,用METTL3抗體的RIP顯示,METTL3在KYSE180和KYSE450細胞中與APC結合(Fig. 3i)。這些結果表明,METTL3與APC結合,并以METTL14依賴的方式提高其m6A水平。
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      (4)METTL3調控APC mRNA中m6A上調從而抑制APC的表達
      為研究METTL3依賴的m6A調控APC的表達,作者構建了一個熒光素酶報告基因,該基因具有完整的編碼序列(CDS)包含WT或從3 '端突變的m6A APC 。熒光素酶分析顯示,METTL3 KO極大地提高了WT APC的熒光素酶活性,而突變的APC提高了熒光素酶活性,并使該活性抵抗敲除METTL3的調控(Fig. 4a)。相反,METTL3過表達抑制WT APC的熒光素酶活性,但沒有抑制突變體中APC的熒光素酶活性(圖4)。這些結果表明,METTL3介導的m6A水平的上調抑制了APC的表達。
      與這一發現一致的是,METTL3 KO增加了APC基因和蛋白的表達(Fig. 4b),而在KYSE450和KYSE180中重組表達METTL3則下調了這一增加(Fig. 4c)。此外,METTL3過表達降低了KYSE450細胞中APC的表達(Fig. 4d),而四環素劑量依賴性增加的METTL3表達水平與APC水平呈負相關(Fig. 4e)。相比之下,METTL3不活躍的突變體與其WT對應體不同,未能調節APC的表達(Fig. 4f)。值得注意的是,ESCC細胞中METTL3的消耗消除了METTL3過表達-降低的APC表達(Fig. 4g)。這些結果表明,METTL3介導的APC  m6A上調協同抑制APC 基因和蛋白的表達ESCC細胞中的METTL14。
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      (5)METTL3增強的了APC mRNA的m6A水平而后YTHDF結合抑制APC的表達
      m6A Reader與m6A修飾的mRNA結合,導致蛋白表達增加或減少。YTHDF1-3介導mRNA降解。RIP-qPCR檢測,發現YTHDF2結合APC 的數量遠遠高于KYSE180中YTHDF1和YTHDF3的數量(Fig. 5a)而METTL3敲除后(Fig. 5b)被還原。這些結果表明,METTL3增加APC 的m6A極大地促進了YTHDF2與APC 的結合。
      為了研究YTHDF2與APC結合在APC表達中的作用,作者敲除了YTHDF2而后APC  (Fig. 5c)和蛋白(Fig. 5d)在細胞中的表達增加。YTHDF1-3的聯合敲除進一步增加了APC 基因(Fig. 5e)和蛋白(Fig. 5f)在這些細胞中的表達。此外,熒光素酶報告實驗發現YTHDF2的缺失增強了含有m6A的WT APC CDS序列驅動的熒光素酶活性。然而突變的APC增強了熒光素酶的活性,并使該活性抵抗YTHDF2 敲除的調控(Fig. 5g)。這些結果表明mett3增加APC 的m6A,隨后結合YTHDF抑制APC的表達。
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      (6)METTL3降低APC表達,促進β-catenin介導的下游基因表達、有氧糖酵解、ESCC細胞增殖與腫瘤發展
      APC功能的缺失可以穩定β-catenin,誘導下游基因的表達(如CCND1和MYC)。促進細胞周期進程,而cMyc(由MYC編碼)通過上調糖酵解基因的表達來促進有氧糖酵解。METTL3缺失增強了KYSE180中APC的表達,降低了β- catenin、cyclin D1、c-Myc和PKM2的表達(Fig. 6a)。然而,METTL3過表達降低了KYSE180中APC的表達,增強了β-catenin、cyclin D1、c-Myc和PKM2的表達。此外,METTL3 KO降低了葡萄糖攝取(Fig. 6b)、乳酸產量(Fig. 6c)、細胞增殖(Fig. 6d)和細胞集落數量。值得注意的是,這種METTL3 KO引起的基因表達的抑制(Fig. 6a),糖酵解(Fig. 6b,c),細胞增殖和菌落形成在APC KO后大部分消失。這些結果表明,METTL3降低APC的表達,促進β-catenin介導的下游基因表達,有氧糖酵解和ESCC細胞增殖。
      為了確定METTL3誘導的APC表達下調在小鼠腫瘤生長中的作用,作者進行了皮下注射實驗。結果發現,METTL3的KO減少了腫瘤的大小(Fig. 6e)、體積(Fig. 6f)和重量(Fig. 6g),以及腫瘤組織中的乳酸含量,這一過程可通過APC KO恢復。此外,IHC染色顯示,METTL3 KO增加了腫瘤組織中APC的表達,相應的β-catenin、cyclin D1、c-Myc和PKM2的表達降低(Fig. 6h,i)。這些結果表明,通過METTL3抑制APC表達促進腫瘤的發展。
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      (7)APC表達下調與METTL3在人食管鱗癌標本中的表達和預后差相關
      為了確定METTL3抑制APC表達的臨床相關性,作者進行了TCGA數據分析,顯示APC 的表達為與食管鱗癌中METTL3 的表達呈負相關(Fig. 7a)。此外,對119對ESCC標本及其鄰近正常組織進行基因表達譜分析,發現APC表達明顯在ESCC中顯著下調(Fig. 7b),免疫組化染色發現METTL3蛋白表達與APC蛋白表達成負相關(Fig. 7c,d),而與β-catenin蛋白表達呈正相關(Fig. 7c,e)。此外,APC的高表達與ESCC患者較長的總生存時間顯著相關(Fig.7f)。上述結果說明APC表達下調與人類METTL3表達上調相關且導致食管鱗癌患者預后差。
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      點評:文章通過m6A-meRIP-Seq結合全轉錄組測序技術(云序提供),通過對測序結果比對分析確認m6A甲基化修飾對腫瘤抑制因子APC起著重要作用。其中去甲基化酶METTL3以依賴于m6A修飾的方式調控APC與YTHDF作用從而促進APC的降解。首次揭示了YTHDF結合METTL3介導的m6A修飾抑制APC的表達,導致Wnt/β-catenin通路在癌癥中以一種外膜調控依賴的方式上調。METTL3/ ythdf偶聯m6A調控APC關鍵調控的發現,可能為ESCC患者的治療提供有前景的方法。

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      云序m6A RNA修飾課題技術服務五大模塊
      1.m6A RNA修飾測序
      通過使用m6A抗體富集高甲基化的RNA的片段,然后結合高通量測序,在全轉錄組范圍內研究發生m6A的區域
      2.m6A RNA修飾靶基因驗證
      云序提供m6A的MeRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證m6A修飾靶基因表達水平。
      3.機制互作研究
      篩選或驗證m6A修飾直接靶點,研究m6A修飾靶基因的調控機制。
      篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
      驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
      4.RNA修飾上游酶的篩選
      尋找上游直接調控m6A甲基化的甲基轉移酶。
      5.檢測整體m6A RNA修飾水平
      精zhun高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。
      周期短、RNA起始量小,低至200ng。
       
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